"МР 3.1.0272-22. 3.1. Профилактика инфекционных болезней. Молекулярно-генетический мониторинг штаммов возбудителя новой коронавирусной инфекции. Методические рекомендации"
ГОСУДАРСТВЕННОЕ САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОЕ НОРМИРОВАНИЕ
РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Утверждаю
Руководитель Федеральной службы
по надзору в сфере защиты прав
потребителей и благополучия человека,
Главный государственный санитарный
врач Российской Федерации
А.Ю.ПОПОВА
10 января 2022 г.
3.1. ПРОФИЛАКТИКА ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ МОНИТОРИНГ
ШТАММОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ НОВОЙ КОРОНАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ
МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
МР 3.1.0272-22
1. Разработаны: Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, ФБУН "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Роспотребнадзора, ФБУН "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Роспотребнадзора, ФКУЗ "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Роспотребнадзора.
2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 10 января 2022 года.
3. Введены впервые.
I. ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ
1.1. Настоящие методические рекомендации информируют об основных принципах организации и проведения молекулярно-генетического мониторинга штаммов возбудителя новой коронавирусной инфекции, циркулирующих на территории Российской Федерации.
1.2. Настоящие методические рекомендации предназначены для специалистов органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также иных организаций, участвующих в проведении данного мониторинга.
1.3. Перечень научных организаций, противочумных учреждений Роспотребнадзора, осуществляющих полногеномное и фрагментное (мультилокусное) секвенирование материала от больных новой коронавирусной инфекцией, доставленного территориальными органами и организациями Роспотребнадзора в субъектах Российской Федерации, иными организациями, представлен в приложении 1 к настоящим методическим рекомендациям.
II. КРИТЕРИИ ЗАБОРА МАТЕРИАЛА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНОВАРИАНТОВ
VOC SARS-COV-2 С ПОМОЩЬЮ СЕКВЕНИРОВАНИЯ
2.1. Приоритетные критерии для забора материала для секвенирования:
- от лиц, прибывших из-за рубежа;
- от контактных с прибывшими из-за рубежа;
- от контактных с лицами, у которых выявлен штамм SARS-CoV-2 "вызывающий озабоченность" (VOC);
- от лиц с подозрением на повторное инфицирование SARS-CoV-2;
- от лиц, инфицированных (с признаками и без признаков заболевания), спустя 30 и более суток после вакцинации;
- от больных с устойчивостью к лечению препаратами на основе специфических антител;
- от всех лиц с нетипичным течением заболевания (длительная вирусемия более 21 дня, наличие симптомов со стороны желудочно-кишечного тракта, нервной системы и др.) без сопутствующей патологии;
- от лиц из эпидемических очагов (в т.ч. семейных);
- от детей и подростков до 17 лет с клиническим признаками заболевания.
С учетом складывающейся эпидемиологической ситуации в субъекте Российской Федерации критерии для забора материала для секвенирования могут быть изменены.
2.2. Дополнительно целесообразно обеспечить забор материала с "потока" - от амбулаторных и стационарных пациентов.
2.3. Общий объем направленных на секвенирование проб из субъектов Российской Федерации - не менее 10% от всех положительных исследований (ПЦР) в неделю.
2.4. Доставка биоматериала осуществляется не менее двух раз в неделю по согласованию с лабораториями, проводящими секвенирование.
2.5. Требования к отбору материала.
2.5.1. В случае положительного результата ПЦР отбирается носоглоточный мазок в транспортной среде, который затем отправляется в соответствующую лабораторию. Допустимые для использования типы транспортных сред определяются строго по согласованию с организацией, осуществляющей секвенирование.
2.5.2. Лаборатории, проводящие секвенирование, самостоятельно определяют пригодность проб для проведения секвенирования.
2.5.3. Образцы необходимо подвергать глубокой заморозке и хранить до передачи в лабораторию в условиях, не допускающих их повторной разморозки, обеспечивая холодовую цепочку при транспортировке материала; при пересылке в течение 24 часов и менее от момента отбора материала образцы допускается перевозить при +4 C, не замораживая.
2.5.4. Для отбора респираторных мазков используются пробирки для взятия респираторных мазков, содержащих транспортную среду. Допускается использование криопробирок объемом 1,5 - 2 мл с внешней резьбой и завинчивающимися крышками с уплотнительным кольцом, исключающим протекание биологической жидкости, в которые внесена транспортная среда в объеме 0,6 мл. Недопустимо использовать другой тип пробирок. Пробирки с материалом должны иметь четкую несмываемую маркировку.
III. ТРЕБОВАНИЯ К СОПРОВОДИТЕЛЬНОЙ ИНФОРМАЦИИ
О ПРЕДОСТАВЛЯЕМОМ МАТЕРИАЛЕ
3.1. Сопроводительная информация должна предоставляться организациям, осуществляющим секвенирование, через заполнение онлайн-формы в соответствии с инструкцией, представленной в приложение 2 "Инструкция по регистрации образца".
3.2. После загрузки обязательной информации образцу выдается уникальный идентификационный номер и формируется сопроводительный лист. Сопроводительный лист распечатывается и вкладывается в посылку, содержащую контейнер с образцами.
3.3 Доступ к заполнению онлайн-формы осуществляется ответственным лицом организации, направляющей образцы на исследование. Для входа в систему используется логин и пароль, предоставляемые по запросу в ФБУН "ЦНИИ Эпидемиологии" Роспотребнадзора. Для получения доступа в систему требуется предоставить информацию в ФБУН "ЦНИИ Эпидемиологии" Роспотребнадзора об ответственном сотруднике (название организации, должность, ФИО, электронная почта, мобильный телефон, заполненный документ приложение 3 "Обязательство о неразглашении конфиденциальной информации").
3.4. Сопроводительная информация должна содержать перечисленные ниже данные об образце (обязательные поля выделены жирным шрифтом и отмечены "*"):
*Название образца (без пробелов, латиница, цифры, нижнее подчеркивание, дефис)
- Тип биоматериала - например, мазок из носо- или ротоглотки, аутопсия и т.п.
- *Место забора материала (в формате Страна/Регион/Город)
- *Дата забора материала в формате (ГГГГ или ГГГГ-ММ или ГГГГ-ММ-ДД)
- *ID образца (идентификационный номер образца из системы report.gsen.ru форма 970)
- *Субъект РФ (в формате Регион/Город)
- Пол пациента - М/Ж
- Возраст пациента - полных лет или неизвестен
- Социальный статус (род занятий/место работы)
- *Ct на ПЦР-тесте
- *Тест-система
- *Завозной случай - ДА/НЕТ
- *Если завозной случай, то дата прибытия в формате (ГГГГ или ГГГГ-ММ или ГГГГ-ММ-ДД)
- *Если завозной случай, то откуда прибыл (Страна прибытия/населенный пункт)
- Дата заболевания (ГГГГ или ГГГГ-ММ или ГГГГ-ММ-ДД)
- Диагноз по МКБ-10
- Клиническая форма заболевания - бессимптомно/ОРВИ/ВП/неизвестно
- Симптомы
- Исход заболевания - болеет/выздоровел/умер/неизвестно
- Госпитализация - - ДА/НЕТ/неизвестно
- *Подозрение на повторное инфицирование SARS-CoV-2 ДА/НЕТ/неизвестно
- *Вакцинация - Привит/Не привит/Не известно
- *Название вакцины (если привит)
- Дата вакцинации (если привит)
- Кратность вакцинации - v1/v2
- Количество контактных лиц
- Из них выявлено лиц с COVID-19
- Если образцы от контактных лиц с COVID-19 поступили на секвенирование (указать идентификационные номера образцов из системы report.gsen.ru форма 970, если известно)
- Предположительный источник инфекции (если установлен)
- Комментарии (свободное поле)
IV. ТРЕБОВАНИЯ К ТРАНСПОРТИРОВАНИЮ МАТЕРИАЛА
4.1. Материал помещается в герметичный, предварительно охлажденный до температуры хранения образцов металлический контейнер (термос с широким горлом), обеспечивающий сохранность терморежима. Допускается поместить в контейнер охлаждающие элементы. Во избежание аварий недопустимо помещать внутрь металлического контейнера (термоса) сухой лед или жидкий азот.
4.2. К наружной поверхности прикрепляют этикетку, содержащую информацию об организации, направившей материал, идентификационные данные материала с перечислением образцов, дату упаковки.
4.3. Маркированный контейнер помещают в термоизолирующую пенопластовую коробку (термоконтейнеры, сумки-термосы), содержащую замороженные хладоэлементы и/или сухой лед в количестве, достаточном для обеспечения непрерывной холодовой цепи до места доставки.
4.4. К наружной стенке коробки прикрепляют этикетку с указанием вида материала, условий транспортирования, названия пунктов назначения, получателя и отправителя с контактными данными. Не допускается указание на этикетке снаружи упаковки любых данных, помимо вышеуказанных.
4.5. Перевозка образцов должна осуществляться в соответствии с требованиями санитарного законодательства по отношению к микроорганизмам II группы патогенности.
4.6. Биоматериал необходимо доставлять в научные организации Роспотребнадзора в течение не более 5 суток от момента забора.
V. АЛГОРИТМ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ВАРИАНТОВ
ВИРУСА SARS-COV-2
5.1. Актуальный список вариантов, подлежащих исследованию, с указанием искомых мутаций, а также их распределения по амплифицируемым фрагментам из протоколов Университета Женевы и ARTIC v.3 или других приводится в техническом бюллетене, обновляемом 1 и 15 числа каждого месяца на портале https://genome.crie.ru/.
В случае оперативной необходимости бюллетень может быть дополнительно актуализирован.
Информация об актуализации данных поступает в виде информационной рассылки с портала https://genome.crie.ru/ в научно-исследовательские организации Роспотребнадзора, осуществляющие проведение секвенирования (приложение 4).
5.2. Для дифференциации геновариантов вируса SARS-CoV-2 используются методы (1) фрагментного секвенирования по Сэнгеру отдельных локусов гена, кодирующего S-белок, (2) секвенирования полной последовательности S-гена или (3) секвенирование полного генома вируса SARS-CoV-2.
5.3. При применении методов секвенирования последовательно проводится (1) амплификация необходимых фрагментов генома SARS-CoV-2, определения наличия продуктов амплификации, (2) секвенирование пригодных образцов выбранным методом, из числа перечисленных ниже, (3) выдача заключения о вероятной принадлежности к искомому геноварианту.
5.4. Сроки проведения оценки качества (амплификация необходимых фрагментов генома SARS-CoV-2, определение наличия продуктов амплификации) - не более 3 суток от момента поставки образцов (96 или менее).
Сроки проведения фрагментного секвенирования пригодных образцов (любым выбранным протоколом) - не более 4 дней от момента получения заключения о качестве.
Сроки проведения секвенирования гена S-белка (любым выбранным протоколом) - не более 7 дней от момента получения заключения о качестве.
Сроки проведения полногеномного секвенирования пригодных образцов (любым выбранным протоколом) - не более 12 дней от момента получения заключения о качестве.
Сроки выдачи заключения о вероятной принадлежности вируса к одному из искомых вариантов - образца не более 1 дня от момента завершения секвенирования.
5.5. Организациям, участвующим в секвенировании, рекомендуется обращать внимание на новые возникающие геноварианты и при закреплении таких в популяции сообщать о них, высылая письмо с описанием геноварианта и рекомендациями по выявлению по адресу crie@pcr.ru".
5.6. Инструкция по работе с программой genome.crie.ru приведена в приложении 5 к настоящим методическим рекомендациям.
Приложение 1
к МР 3.1.0272-22
ПЕРЕЧЕНЬ
НАУЧНЫХ ОРГАНИЗАЦИЙ, ПРОТИВОЧУМНЫХ УЧРЕЖДЕНИЙ
РОСПОТРЕБНАДЗОРА, ОСУЩЕСТВЛЯЮЩИХ СЕКВЕНИРОВАНИЕ
Перечень учреждений, осуществляющих секвенирование
Субъекты
Фрагментное (мультилокусное)
Полногеномное
ФБУН "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора"
ФБУН "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора"
Владимирская,
Ивановская,
Костромская,
Рязанская,
Смоленская,
Тверская,
Липецкая,
Тамбовская,
Ярославская области
Москва
Магаданская область,
Чукотский автономный округ,
Камчатский край
ФБУН "Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии" Роспотребнадзора
ФБУН "Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии" Роспотребнадзора
Калужская,
Московская,
Орловская,
Тульская
Белгородская,
Воронежская
Брянская
Курская области
ФБУН "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера" Роспотребнадзора
ФБУН "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера" Роспотребнадзора
Республики
Карелия,
Коми,
Ненецкий
автономный округ,
Архангельская,
Вологодская,
Ленинградская,
Новгородская,
Псковская
Мурманская
Калининградская области
г. Санкт-Петербург
ФКУЗ "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Роспотребнадзора
ФКУЗ "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Роспотребнадзора
Республики
Башкортостан
Удмуртская
Татарстан
Самарская
Пензенская,
Саратовская,
Ульяновская
Оренбургская области
ФБУН "Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени академика И.Н. Блохиной" Роспотребнадзора
ФКУЗ "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб"
Республики
Мордовия
Марий Эл
Чувашская
Нижегородская
Кировская области, Пермский край
ФБУН "Тюменский научно-исследовательский институт краевой инфекционной патологии" Роспотребнадзора
ФБУН "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Роспотребнадзора
Челябинская
Курганская
Свердловская
Тюменская области, Ханты-Мансийский
Ямало-Ненецкий автономные округа
ФКУЗ "Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт" Роспотребнадзора
ФКУЗ "Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт" Роспотребнадзора
Волгоградская
Астраханская области
Республика Калмыкия
ФКУЗ "Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт" Роспотребнадзора
ФКУЗ "Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт" Роспотребнадзора
Краснодарский край
Республика Адыгея
ФБУН "Ростовский научно-исследовательский институт микробиологии и паразитологии" Роспотребнадзора
ФКУЗ "Ростовский научно-исследовательский противочумный институт" Роспотребнадзора
Ростовская область
Крым,
г. Севастополь
ФКУЗ "Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт" Роспотребнадзора
ФКУЗ "Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт" Роспотребнадзора
Республики Северная Осетия - Алания,
Ингушская,
Чеченская,
Дагестан
Кабардино-Балкарская,
Карачаево-Черкесская,
Ставропольский край
ФБУН "Омский научно-исследовательский институт природно-очаговых инфекций" Роспотребнадзора
"Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Роспотребнадзора
Омская,
Томская,
Кемеровская области
ФКУЗ "Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока" Роспотребнадзора
ФКУЗ "Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока" Роспотребнадзора
Иркутская область
Республика Бурятия,
Забайкальский край
Республика Хакасия,
Красноярский край
Республика Алтай,
Алтайский край
Республика Тыва
ФБУН "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Роспотребнадзора
"Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Роспотребнадзора
Новосибирская область
ФБУН "Хабаровский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии" Роспотребнадзора
"Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Роспотребнадзора
Республика Саха (Якутия),
Хабаровский край,
Приморский край,
Еврейская автономная область,
Сахалинская,
Амурская область
ФБУН "Научно-исследовательский институт дезинфектологии" Роспотребнадзора
Коммерческие организации осуществляющие молекулярно-генетические исследования (ПЦР)
Приложение 2
к МР 3.1.0272-22
ТРЕБОВАНИЯ
К ФАЙЛАМ, СОДЕРЖАЩИМ ИНФОРМАЦИЮ
О НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ
Каждый геном SARS-CoV-2 должен быть представлен одной нуклеотидной последовательностью в форматах "*.fasta", "*.fas", "*.fa".
Требования к наименованию последовательности:
- должно содержать латинские буквы, цифры, нижнее подчеркивание, не должно содержать пробелов
- должно быть полностью идентично названию образца, введенному в форму для представления метаданных.
Требования к буквенным обозначениям нуклеотидов в файлах:
- в случае наличия не покрытых (неотсеквенированных) областей в геноме, они должны быть замаскированы последовательностью, состоящей из букв NNN;
- в случае наличия вырожденных нуклеотидных позиций они обозначаются вырожденным кодом, согласно номенклатуре IUPAC (например R, для обозначения A/G и т.п.)".
Приложение 3
к МР 3.1.0272-22
Приложение 4
к МР 3.1.0272-22
ПЕРЕЧЕНЬ ИДЕНТИФИЦИРУЕМЫХ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ВАРИАНТОВ SARS-COV-2
В настоящее время (на 10.01.2022) к вариантам ВЭП (VOC) относятся штаммы, принадлежащие к линиям:
- Alpha, B.1.1.7 ("Британский");
- Beta, B.1.351 ("ЮАР");
- Gamma, P.1 линии B.1.1.28 ("Бразильский");
- Kappa, B.1.617.1 ("Индийский.1");
- Delta, B.1.617.2 ("Индийский.2").
- Omicron, B.1.1.529 ("Южно-Африканский")
К вариантам ТДИ (VUI) (на 12.06.2021) относятся:
- AT.1 линии B.1.1.370.1;
- B.1.1.523 (ранее относился к линии B.1.1.451, согласно PANGOILIN)
Ниже приводятся рекомендации по дифференциации вышеуказанных геновариантов с помощью методов (1) фрагментного секвенирования по Сэнгеру отдельных локусов гена, кодирующего S-белок, (2) секвенирования по Сэнгеру полного гена S-белка, (3) полногеномного секвенирования.
Информация о характерных мутациях S-гена для каждой линии приведена в таблице 1.
Таблица 1. Характерные мутации S-гена геновариантов ВЭП и ТДИ.
Мутации гена S
Alpha, B.1.1.7
H69-, V70-, Y144-, N501Y, A570D, D614G, P681H, T716I, S982A, D1118H
Beta, B.1.351
D80A, D215G, L241-, L242-, A243-, K417N, E484K, N501Y, D614G, A701V
Gamma, P.1
L18F, T20N, P26S, D138Y, R190S, K417T, E484K, N501Y, D614G, H655Y, T1027I, V1176F
Delta, B.1.617.2
T19R, E156-, F157-, R158G, L452R, T478K, D614G, P681R, D950N
Kappa, B.1.617.1
G142D, E154K, L452R, E484Q, D614G, P681R, Q1071H
AT.1 линии B.1.1.370.1
P9L, D215G, C136-, N137-, D138-, P139-, F140-, L141-, G142-, V143-, Y144-, H245P, F306I, T307S, V308C, E309R, K310S, G311V, I312L, E484K, N679K, ins_679_GIAL, E780K
B.1.1.523
E156-, F157-, R158-, F306L, E484K, S494P, E780A
B.1.1.529
1. Алгоритм дифференциации генетических вариантов вируса SARS-CoV-2 с помощью фрагментного секвенирования по Сэнгеру отдельных локусов гена, кодирующего S-белок.
Дифференциацию геновариантов вируса SARS-CoV-2 по локусам из протоколов Университета Женевы и ARTIC осуществляют в соответствии с таблицей 2, определяя делеции 21765-21770 (делеция HV 69-70), 21991-21993 (делеция Y144), 22287-22295 (делеция LAL 242-244), 21969-21995 (делеция CNDPFLGNY 136-144), замены A21801C (замена D80A), G21974T (замена D138Y), G22132T (замена R190S), A22206G (замена D215G), A22296C (замена H245P), T22917G (замена L452R), C22995A (замена T478K), G23012A (замена E484K), G23012C (замена E484Q), A23063T (замена N501Y), C23271A (замена A570D). Нумерация нуклеотидных остатков приведена относительно референс-штамма hCoV-19/Wuhan/WIV04/2019 (EPI_ISL_402124).
На идентификацию геноварианта B.1.1.7 ("Британский") направлено обнаружение при секвенировании фрагмента F44-R44 или nCoV-2019_72 делеций 21765-21770 (HIV 69-70), 21991-21993 (Y144), а также обнаружение замены A23063T (N501Y) при секвенировании фрагмента F47-R47 или nCoV-2019_76, замены C23271A (A570D) при секвенировании фрагмента F47-R47 или nCoV-2019_77.
На идентификацию геноварианата B.1.351 ("ЮАР") направлено обнаружение при секвенировании фрагмента F44-R44 или nCoV-2019_72 замены A21801C (D80A), а также обнаружение делеции 22287-22295 (LAL 242-244) и замены A22206G (D215G) при секвенировании фрагмента nCoV-2019_73, замен G23012A (E484K) и A23063T (N501Y) при секвенировании фрагмента F47-R47 или nCoV-2019_76.
На идентификацию геноварианата - P.1 линии B.1.1.28 ("Бразильский") направлено обнаружение при секвенировании фрагмента F44-R44 или nCoV-2019_72, замены G21974T (D138Y), а также обнаружение замены G22132T (R190S) при секвенировании фрагмента nCoV-2019_73, замен G23012A (E484K) и A23063T (N501Y) при секвенировании фрагмента F47-Я47 или nCoV-2019_76.
На идентификацию геноварианата B.1.617.1 ("Индийский. 1") направлено обнаружение при секвенировании nCoV-2019_76 замен T22917G (L452R) и G23012C (E484Q) для филогенетической линии B.1.617.1 и замен T22917G (L452R).
На идентификацию геноварианата B.1.617.2 ("Индийский.2") направлено обнаружение при секвенировании nCoV-2019_76 замен T22917G (L452R) и G23012C (E484Q) для филогенетической линии B.1.617.1 и замен T22917G (L452R), а также C22995A (T478K) для филогенетической линии B.1.617.2.
На идентификацию геноварианта B.1.1.523 направлено обнаружение при секвенировании фрагмента F44-R45 или nCoV-2019_(72_Left+73_Right) делеции 22029-22037 (EFR 156-158), замен G23012A (E484K) и t23042c (S494P) при секвенировании фрагмента F47-R47 или nCoV-2019_76.
На идентификацию геноварианта AT.1 линии B.1.1.370.1 направлено обнаружение при секвенировании фрагмента F44-R44 или nCoV-2019_72 делеции 21969-21995 (CNDPFLGNY 136-144), а также обнаружение замен A22206G (D215G), A22296C (H245P) при секвенировании фрагмента nCoV-2019_73, замены G23012A (E484K) при секвенировании фрагмента F47-R47 или nCoV-2019_76.
Таблица 2. Список мутаций генетических вариантов вируса SARS-CoV-2, детектируемых при фрагментом секвенировании
По протоколу Университета Женевы
По протоколу ARTIC v.3
Генетические варианты SARS-CoV-2
Фрагмент F44-R45, внутренний фрагмент F44-R44 <1>
Фрагмент F46-R47, внутренний фрагмент F47-R47
Фрагмент nCoV-2019_72
Фрагмент nCoV-2019_73
Фрагмент nCoV-2019_76
Фрагмент nCoV-2019_77
Делеция HIV69-70, Y144
Замены N501Y
A570D
Делеция HIV69-70, Y144
нет
Замена N501Y
Замена A570D
Alpha B.1.1.7 (Британский)
Замена D80A
Замены N501Y
E484K
Замена D80A
Делеция LAL 242-244
Замена D215G
Замены N501Y
E484K
нет
Beta B.1.351 (ЮАР)
Замена D138Y
Замены N501Y
E484K
Замена D138Y
Замена R190S
Замены N501Y
E484K
нет
Gamma P.1, B.1.1.28 (Бразилия)
Замены G142D
<2> E154K <2>
Замены L452R <3> E484Q
Замена T95I <2>
G142D
нет
Замены L452R
E484Q
нет
Kappa B.1.617.1 (Индия.1)
Делеция FR156-157 <1>
Замена R158G <1>
Замены L452R <3>
T478K <3>
нет
Делеция FR156-157 <1>
Замена R158G <1>
Замены L452R
T478K
нет
Delta B.1.617.2 (Индия.2) <1>
Делеция EFR156-158 <1>
E484K
S494P
нет
Делеция EFR156-158
E484K
S494P
нет
B.1.1.523
Делеция CNDPFLGNY 136-144
E484K <1>
Делеция CNDPFL GNY 136-144
Замена <5> D215G H245P
E484K
нет
AT.1 линии B.1.1.370.1 (северо-западный) <4>, <5>
--------------------------------
<1> Использование праймера R44 из протокола Университета Женевы и nCoV-2019_72_Right из протокола ARTIC v.3 может быть неэффективным для идентификации геноварианта B.1.617.2 (Индия.2)! (праймеры относятся к зоне делеции).
<2> Наличие данных замен и/или делеций является возможным, но не определяющим. Определяющими стоит считать замены в положениях 452, 478, 484.
<3> Идентификация данных замен возможна только при секвенировании фрагмента F46-R47.
<4> В случае геноварианта AT.1 линии B.1.1.370.1 (северо-западный) использование праймера F46 из протокола Университета Женевы может быть неэффективным!
<5> При определении геноварианта AT.1 линии B.1.1.370.1 (северо-западный) использование праймера nCoV-2019_73_Left из протокола ARTIC v.3 невозможно!
Рекомендуемые протоколы исследования с помощью фрагментного секвенирования по Сэнгеру отдельных локусов гена, кодирующего S-белок:
Для амплификации участков, содержащих нуклеотидные замены, необходимые для определения геновариантов вируса SARS-CoV-2, используют олигонуклеотидные праймеры, указанные в Протоколе Университета Женевы (Geneva, December 26th, 2020, Rue Gabrielle-Perret-Gentil 4, 1211 Geneva 14, Switzerland), см таблицу 3.
Таблица 3. Праймеры используемые по протоколу Университета Женевы.
Обозначение
Последовательность (5'-3')
F44
TCTCTTCTTAGTAAAGGTAGACTT
F46 <2>
CCTTCACTGTAGAAAAAGGAATC
F47
TATCAGGCCGGTAGCACAC
R45
CTAACAATAGATTCTGTTGGTTG
R44 <1>
GAATAAACTCTGAACTCACTTTCC
R47
CATATGAGTTGTTGACATGTTCAG
--------------------------------
<1> Использование праймера R44 из протокола Университета Женевы может быть неэффективным для идентификации геноварианта B.1.617.2 (Индия.2)! (праймеры попадают в зону делеций).
<2> В случае геноварианта AT.1 линии B.1.1.370.1 (северо-западный) использование праймера F46 из протокола Университета Женевы может быть неэффективным!
При исследовании проб с низкими значениями Ct <= 20 (высокая вирусная нагрузка) достаточно одного раунда ПЦР с праймерами F44-R44 и F47-R47, обеспечивающими образование фрагментов 570 п.н. и 565 п.н., соответственно.
При исследовании проб с высокими значениями Ct >= 25 (низкая вирусная нагрузка) используется гнездовая ПЦР.
Первоначально проводят амплификацию с праймерами F44-R45 и F46-R47, фланкирующими фрагменты размером 1071 п.н. и 1068 п.н., а затем осуществляют вторую ПЦР с праймерами F44-R44 и F47-R47, где в качестве исследуемой ДНК используют ампликоны, полученные в первом раунде, см. таблицу 4.
Таблица 4. Рекомендуемые условия проведения реакции амплификации при использовании Протокола Университета Женевы.
Матричный режим
1 этап
2 этап
5 этап
6 этап
95 °C - 5 мин
95 °C - 30 с
55 °C - 30 с
72 °C - 70 с
38 циклов
72 °C - 4 мин
10 °C - хранение
В качестве альтернативного способа рекомендуется использовать пары праймеров nCoV-2019_72, nCoV-2019_76 и nCoV-2019_77 из протокола ARTIC v.3 (nCoV-2019 sequencing protocol v3 (LoCost) (protocols.io), см. таблицу 5.
Таблица 5. Праймеры используемые по протоколу ARTIC v.3.
Обозначение
Последовательность (5'-3')
nCoV-2019_72_LEFT
ACACGTGGTGTTTATTACCCTGAC
nCoV-2019_72_RIGHT
ACTCTGAACTCACTTTCCATCCAAC
nCoV-2019_73_LEFT
CAATTTTGTAATGATCCATTTTTGGGTGT
nCoV-2019_73_RIGHT
CACCAGCTGTCCAACCTGAAGA
nCoV-2019_76_LEFT
AGGGCAAACTGGAAAGATTGCT
nCoV-2019_76_RIGHT
ACACCTGTGCCTGTTAAACCAT
nCoV-2019_76_LEFT_alt3
GGGCAAACTGGAAAGATTGCTGA
nCoV-2019_76_RIGHT_alt0
ACCTGTGCCTGTTAAACCATTGA
nCoV-2019_77_LEFT
CCAGCAACTGTTTGTGGACCTA
Рекомендуемые условия проведения реакции амплификации при использовании Протокола ARTIC v.3 см. таблица 6.
Таблица 6. Рекомендуемые условия проведения реакции амплификации при использовании протокола ARTIC v.3
Матричный режим
1 этап
3 этап
4 этап
5 этап
6 этап
95 °C - 5 мин
95 °C - 60 с
62 °C - 60 с
72 °C - 60 с
10 циклов
95 °C - 30 с
60 °C - 30 с
72 °C - 30 с
30 циклов
72 °C - 5 мин
10 °C - хранение
Допустимо также использовать праймеры из иных протоколов, позволяющие проводить амплификацию и последующее фрагментное секвенирование участков генома SARS-CoV-2, содержащих перечисленные нуклеотидные замены.
В качестве замены праймерам R44 из протокола Университета Женевы и nCoV-2019_72_Right из протокола ARTIC v.3 может быть использован праймер CACV_51_R, праймеру F46 из протокола Университета Женевы - праймер CACV_55_F и праймеру nCoV-2019_73_Left из протокола ARTIC v.3 - праймер CACV_52_F (таблица 7).
Таблица 7. Праймеры, рекомендуемые для замены неработающих поаймеров из протоколов Университета Женевы и протокола ARTIC v.3
Название
Последовательность 5'-3'
Длина, пн
CACV_51_R
GAG GGA GAT CAC GCA CTA AA
20
CACV_55_F
ATG GAA CCA TTA CAG ATG CTG TAG
24
CACV_52_F
TGG ATG GAA AGT GAG TTC AGA G
22
2. Алгоритм дифференциации генетических вариантов вируса SARS-CoV-2 с помощью фрагментного секвенирования полной последовательности гена, кодирующего S-белок.
Для дифференциации генетических вариантов вируса SARS-CoV-2 с помощью фрагментного секвенирования полной последовательности гена, кодирующего S-белок предлагается использовать тот же алгоритм, что и указанный выше для фрагментного секвенирования отдельных локусов.
Для амплификации полного гена S, необходимого для определения геновариантов вируса SARS-CoV-2, используют олигонуклеотидные праймеры из протокола ARTIC v3, перекрывающие полную нуклеотидную последовательность гена S SARS-CoV-2 длиной 3822 нуклеотидных оснований (позиция в геноме 21562 - 25384 н.о.).
Их последовательности и позиции в геноме, а также длина ожидаемых ампликонов, указаны ниже (см. таблица 8). Рекомендуемые условия проведения реакции амплификации при использовании протокола ARTIC v.3 приведены в таблице 8.
Таблица 8. Нуклеотидные последовательности и позиции в геноме олигонуклеотидных праймеров для секвенирования гена S SARS-CoV-2 (протокол ARTIC v3).
--------------------------------
<*> ВНИМАНИЕ! Структура праймера N 1 (nCoV-2019_72_LEFT_alt) является уникальной, не входит в набор оригинального протокола ARTIC v3 и требует отдельного заказа.
name
Позиция
seq
length
%gc
Длина ампликона
1
nCoV-2019_72_LEFT_alt
21508 - 21544
FGAGTTGTTATTTCTAGTGATGTTCTTG
27
33.00
530
2
nCoV-2019_72_RIGHT
22014 - 22038
ACTCTGAACTCACTTTCCATCCAAC
25
44.00
3
nCoV-2019_73_LEFT
21962 - 21990
CAATTTTGTAATGATCCATTTTTGGGTGT
29
31.03
384
4
nCoV-2019_73_RIGHT
22327 - 22346
CACCAGCTGTCCAACCTGAAGA
22
54.55
5
nCoV-2019_74_LEFT
22263 - 22290
ACATCACTAGGTTTCAAACTTTACTTGC
28
35.71
387
6
nCoV-2019_74_RIGHT
22627 - 22650
GCAACACAGTTGCTGATTCTCTTC
24
45.83
7
nCoV-2019_75_LEFT
22517 - 22542
AGAGTCCAACCAACAGAATCTATTGT
26
38.46
386
8
nCoV-2019_75_RIGHT
22878 - 22903
ACCACCAACCTTAGAATCAAGATTGT
26
38.46
9
nCoV-2019_76_LEFT_alt3
22799 - 22821
GGGCAAACTGGAAAGATTGCTGA
23
47.83
413
10
nCoV-2019_76_RIGHT_alt0
23190 - 23212
ACCTGTGCCTGTTAAACCATTGA
23
43.48
11
nCoV-2019_77_LEFT
23123 - 23144
CCAGCAACTGTTTGTGGACCTA
22
50.00
399
12
nCoV-2019_77_RIGHT
23501 - 23522
CAGCCCCTATTAAACAGCCTGC
22
54.55
13
nCoV-2019_78_LEFT
23444 - 23466
CAACTTACTCCTACTTGGCGTGT
23
47.83
403
14
nCoV-2019_78_RIGHT
23823 - 23847
TGTGTACAAAAACTGCCATATTGCA
25
36.00
15
nCoV-2019_79_LEFT
23790 - 23812
GTGGTGATTCAACTGAATGCAGC
23
47.83
379
16
nCoV-2019_79_RIGHT
24146 - 24169
CATTTCATCTGTGAGCAAAGGTGG
24
45.83
17
nCoV-2019_80_LEFT
24079 - 24100
TTGCCTTGGTGATATTGCTGCT
99
45.45
388
18
nCoV-2019_80_RIGHT
24444 - 24467
TGGAGCTAAGTTGTTTAACAAGCG
24
41.67
19
nCoV-2019_81_LEFT
24292 - 24416
GCACTTGGAAAACTTCAAGATGTGG
25
44.00
497
20
nCoV-2019_81_RIGHT
24766 - 24789
GTGAAGTTCTTTTCTTGTGCAGGG
24
45.83
21
nCoV-2019_82_LEFT
24697 - 24721
GGGCTATCATCTTATGTCCTTCCCT
25
48.00
379
22
nCoV-2019_82_RIGHT
25053 - 25076
TGCCAGAGATGTCACCTAAATCAA
24
41.67
23
nCoV-2019_83_LEFT
24979 - 25003
TCCTTTGCAACCTGAATTAGACTCA
25
40.00
390
24
nCoV-2019_83_RIGHT
25401 - 25369
TTTGACTCCTTTGAGCACTGGC
22
50.00
Таблица 9. Рекомендуемые условия проведения реакции амплификации при использовании праймеров из протокола ARTIC v3. <*>
Матричный режим
1 этап
3 этап <*>
5 этап
6 этап
95 °C - 30 с
95 °C - 30 с
55 °C - 10 с
72 °C - 40 с
30 - 35 циклов
72 °C - 2 мин
10 °C - хранение
--------------------------------
<*> Данный температурный режим указан для протокола на основе 
High-Fidelity DNA Polymerase. При использовании других ферментов может потребоваться проведение оптимизации условий реакции.
При невозможности использования праймеров из протокола ARTIC v.3 предлагается использовать альтернативный набор праймеров из протокола ЦНИИЭ (неопубликованные данные) или отдельные праймеры, см. таблица 10.
Таблица 10. Нуклеотидные последовательности и позиции в геноме олигонуклеотидных праймеров для секвенирования гена S SARS-CoV-2 (протокол ЦНИИЭ).
Название праймера
Позиция
Последовательность 5'-3'
Длина
Длина ампликона, пн
Cacv51_F
21420 - 21440
AAG GGG TAC TGC TGT TAT GTC
21
795
Cacv51_R
22195 - 22214
GAG GGA GAT CAC GCA CTA AA
20
Cacv52_F
22016 - 22037
TGG ATG GAA AGT GAG TTC AGA G
22
526
Cacv52_R
22518 - 22541
CAA TAG ATT CTG TTG GTT GGA CTC
24
Cacv55_F
22407 - 22430
ATG GAA CCA TTA C AG ATG CTG TAG
24
585
Cacv55_R
22971 - 22991
TAC CGG CCT GAT AGA TTT CAG
21
Cacv07_F
22842 - 22861
ATG ATT TTA CAG GCT GCG TT
20
637
Cacv08_R
23072 - 23091
CCT GTA GAA TAA ACA CGC CA
20
Cacv81_F
23261 - 23282
AGA GAC ATT GCT GAC ACT ACT G
22
585
Cacv81_R
23821 - 23845
TGT ACA AAA ACT GCC ATA TTG CAA C
25
Cacv82_F
23684 - 23709
TCT AAT AAC TCT ATT GCC ATA CCC AC
26
538
Cacv82_R
24200 - 24221
TCC AAC CAG AAG TGA TTG TAC C
22
Cacv83_F
24122 - 24145
AAG TTT AAC GGC CTT ACT GTT TTG
24
592
Cacv83_R
24690 - 24713
ACA TAA GAT GAT AGC CCT TTC CAC
24
Cacv84_F
24587 - 24611
ACT CAA CAA TTA ATT AGA GCT GCA G
25
585
Cacv84_R
25149 - 25171
AAG TTC TTG GAG ATC GAT GAG AG
23
Cacv85_F
24810 - 24833
ATG ATG GAA AAG CAC ACT TTC CTC
24
666
Cacv09_R
25281 - 25300
AAA TCT GAA GGA GTA GCA TCC TTG
24
Рекомендуемые условия проведения реакции амплификации при использовании праймеров из протокола ЦНИИЭ приведены в таблице 11.
Таблица 11. Рекомендуемые условия проведения реакции амплификации при использовании праймеров из протокола ЦНИИЭ.
Матричный режим
1 этап
3 этап <*>
5 этап
6 этап
95 °C - 5 мин
95 °C - 30 с
52 °C - 30 с
72 °C - 60 с
30 - 35 циклов
72 °C - 5 мин
10 °C - хранение
--------------------------------
<*> Данный температурный режим указан для протокола на основе Taq-полимеразы. При использовании других ферментов может потребоваться проведение оптимизации условий реакции.
Допустимо также использовать праймеры из иных протоколов, позволяющие проводить амплификацию и последующее фрагментное секвенирование последовательности S-гена SARS-CoV-2.
3. Алгоритм дифференциации генетических вариантов вируса SARS-CoV-2 с помощью проведения полногеномного секвенирования
Для заключения о геноварианте SARS-CoV-2 в исследованной пробе рекомендуется использовать алгоритм классификации PANGOLIN (https://cov-lineages.org/).
Для секвенирования полной последовательности геномов SARS-CoV-2 рекомендуется использовать (на выбор) праймерную панель и протокол подготовки библиотек:
- ARTIC v.3 https://www.protocols.io/view/ncov-2019-sequencing-protocol-bbmuik6w
- SCV-2000bp https://www.protocols.io/view/protocol-for-scv-2000bp-a-primer-panel-for-sars-co-bn77mhrn.html
- любые иные праймерные панели и протоколы, позволяющие осуществить амплификацию полного генома SARS-CoV-2".
Приложение 5
к МР 3.1.0272-22
ИНСТРУКЦИЯ ПО РАБОТЕ С ПРОГРАММОЙ GENOME.CRIE.RU
Интерфейс работы с образцами.
Версия 1.4.0.
Управление документом.
Авторы
ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии, Информационно-аналитический отдел.
Файл
Создан
06.02.2021
Последнее редактирование
03.03.2021
Количество страниц
11
Версия
Дата изменения
Описание изменения
Автор изменения
1.0.0
08.02.21
Составлена первая версия инструкции
Евстифеев Е.А.
1.1.0
10.02.21
Обновлены скриншоты из программы
Евстифеев Е.А.
1.1.0
10.02.21
Добавлено дополнительное описание при заполнении формы единичной загрузки
Евстифеев Е.А.
1.2.0
03.03.21
Обновлено описание полей реестра.
Евстифеев Е.А.
1.3.0
28.04.21
Добавлено описание для работы региона, выделено в отдельную инструкцию.
Евстифеев Е.А.
1.4.0
07.05.21
Обновлено описание по меню
Евстифеев Е.А.
Предназначение системы
Проект - Российская платформа агрегации информации о геноме.
Задача системы - обеспечение быстрого доступа к данным об эпидемиях и пандемических вирусах.
Реализация проекта направлена на быстрый обмен данными по вирусу, в частности, по коронавирусу, вызывающем COVID-19. Это включает генетическую последовательность и соответствующие клинические и эпидемиологические данные, связанные с вирусами человека, а также географические и иные данные, связанные с вирусами. Это позволяет исследователям понять, как вирусы развиваются и распространяются во время эпидемий и пандемий.
Предоставление доступа
Доступ представляет собой ссылку на адрес для входа, логин и пароль. Доступ предоставляется посредством электронного обмена.
Авторизация в системе
При входе в систему появляется окно с запросом на авторизацию. В окне необходимо ввести логин и пароль, предоставленные пользователю, затем нажать кнопку "Войти":
Основное окно программы для работы с образцами
Данное окно доступно только для авторизованных пользователей, обладающих правами по работе с образцами.
В нем доступен следующий функционал:
1. Новый образец
2. Образцы
3. Реестр образцов
3.1. Создать реестр
3.2. Список реестров
1. Новый образец
По нажатию на данный пункт открывается окно оформления нового образца:
После загрузки файла и заполнения данных система отобразит окно об успешности загрузки:
Затем можно сразу начать оформление нового образца, либо посмотреть результат сохранения в разделе "Образцы".
2. Образцы
В данном разделе представлены все образцы с их статусами. По мере прохождения по процессу обработки образца статус будет изменяться. В правом верхнем углу расположена кнопка "Отчеты". Она позволяет выгружать данные, которые отображены на экране, в виде отчета.
Таким образом, есть возможность сформировать отчет и получить результаты по всем образцам в статусе "Предварительный результат", либо только готовы образцы.
3. Реестр образцов
3.1. Создать реестр
Для создания реестра необходимо перейти в раздел Реестры -> Создать реестр.
В нем можно выбрать все образцы, доступные для отправки посредством создания реестра.
С помощью чек-бокса галочками выбираются нужные образцы:
После этого необходимо нажать кнопку создания реестра:
После нажатия кнопки требуется подтвердить отправку реестра с данными записями:
На следующем шаге распечатать сам реестр:
ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора
Реестр образцов #36
Идентификатор реестра: 36
Количество проб: 6
Организация: ФБУЗ ЦГиЭ в Костромской области
Лаборатория: ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора
Дата формирования: 20.05.2021 16:24:04
N
Название
Номер образца
Дата забора биоматериала
Дата регистрации
ct
1
SARS-Cov-2/Russia/KOS-KOSTROMA-6854/2021
kostSM000005
17.05.2021
20.05.2021
19.42
2
SARS-Cov-2/Russia/KOS-KOSTROMA-6852/2021
kostSM000006
17.05.2021
20.05.2021
16.24
3
SARS-COV-2/Russia/KOS-KOSTROMA-6688/2021
kostSM000007
10.05.2021
20.05.2021
17.57
4
SARS-Cov-2/Russia/KOS-KOSTROMA-6647/2021
kostSM000008
11.05.2021
20.05.2021
12.8
5
SARS-Cov-2/RuSSia/KOS-KOSTROMA-6646/2021
kostSM000009
11.05.2021
20.05.2021
8.36
6
6641
kostSM000010
10.05 2021
20.05.2021
17.67
ПРИМЕЧАНИЕ:
Сотрудник:
<*> Курьер:
Подпись
ФИО
Подпись
ФИО
Полученный реестр нужно подписать и передать курьеру.
3.2. Список реестров
В данном разделе доступна история всех отправленных реестров. При нажатии на его номер можно открыть конкретный реестр и распечатать его повторно.
В самой таблице указана как дата отправки, так и дата принятия реестра.
#30
Отправлен
ФБУЗ ЦГиЭ в Магаданской области (magadan)
18.05.2021
#29
Отправлен
ФБУЗ ЦГиЭ в Липецкой области (lipetsk)
18.05.2021
#28
Отправлен
ЦНИИ Эпидемиологии (crie)
14.05.2021
#27
Отправлен
ЦНИИ Эпидемиологии (crie)
14.05.2021
Реестр может находится в 2 статусах:
- "Принят";
- "Отправлен".